? ? ? ? ? ?
วิธีการและข้อควรระวังในการเก็บรักษาเซลล์ด้วยความเย็น
บ้าน / ข่าว / ข่าวอุตสาหกรรม / วิธีการและข้อควรระวังในการเก็บรักษาเซลล์ด้วยความเย็น

วิธีการและข้อควรระวังในการเก็บรักษาเซลล์ด้วยความเย็น

? ? ? ? ? ? ? ?
Date:2021-09-03 0:00:00 Friday
Summary: 1. เซลล์ที่จะแช่เย็นควรอยู่ในสภาพเจริญเติบโตดี (ระยะล็อก) และมีอัตราการรอดชีวิตสูง โดยมีความหนาแน่นประมาณ 80-90% 2. ตรวจสอบว่าเซลล์ยังคงรักษาคุณสมบัติเฉพาะของตนไว้ก่อนที่จะแช่แข็งหรือไม่ ตัวอย่างเช่น ไฮบริโดมาควรได้รับการทดสอบสำห......

1. เซลล์ที่จะแช่เย็นควรอยู่ในสภาพเจริญเติบโตดี (ระยะล็อก) และมีอัตราการรอดชีวิตสูง โดยมีความหนาแน่นประมาณ 80-90%
2. ตรวจสอบว่าเซลล์ยังคงรักษาคุณสมบัติเฉพาะของตนไว้ก่อนที่จะแช่แข็งหรือไม่
ตัวอย่างเช่น ไฮบริโดมาควรได้รับการทดสอบสำหรับการผลิตแอนติบอดีหนึ่งถึงสองวันก่อนการเก็บรักษาด้วยการแช่เยือกแข็ง
3. ใส่ใจกับคุณภาพของสารป้องกันความเย็น
DMSO ควรเป็นเกรดรีเอเจนต์ ปลอดเชื้อ และไม่มีสี (กรองด้วย FGLP Telflon 0.22 ไมครอนหรือผลิตภัณฑ์ที่ซื้อโดยตรงที่ปลอดเชื้อ เช่น Sigma D-2650) แบ่งเป็นส่วนย่อยในปริมาณเล็กน้อย 5-10 มล. และเก็บที่อุณหภูมิ 4 oC ในที่มืด อย่าละลายน้ำแข็งหลายครั้ง กลีเซอรอลควรเป็นเกรดรีเอเจนต์และเก็บไว้ในที่มืดหลังจากการนึ่งฆ่าเชื้อ ใช้ภายใน 1 ปีหลังเปิดใช้ เพราะจะเป็นพิษต่อเซลล์หลังการเก็บรักษาเป็นเวลานาน
4. ความเข้มข้นของเซลล์ในการเก็บรักษาด้วยความเย็น:
(1) ไฟโบรบลาสต์ของมนุษย์ปกติ: 1~3 x 106 เซลล์/มล.
(2) ไฮบริโดมา: 1~3 x 106 เซลล์/มล. ความเข้มข้นของเซลล์ไม่ควรสูงเกินไป ไฮบริโดมาบางตัวจะตายหลังจากการละลาย 24 ชั่วโมงเนื่องจากความเข้มข้นของการแช่แข็งสูง
(3) เส้นเนื้องอกที่เกาะติดกัน: 5~7 x 106 ขึ้นอยู่กับชนิดของเซลล์ มะเร็งต่อมน้ำเหลืองต้องการความเข้มข้นที่สูงขึ้นหลังจากการละลาย ในขณะที่ HeLa ต้องการเพียง 1-3 x 106 เซลล์/มล.
(4) สารแขวนลอยอื่นๆ: 5~10 x 106 เซลล์/มล. ลิมโฟไซต์ของมนุษย์ต้องมีอย่างน้อย 5 x 106 เซลล์/มล.
5. ความเข้มข้นของสารป้องกันความเย็นคือ 5 หรือ 10% DMSO หากสภาวะการแช่แข็งของเซลล์ไม่แน่นอน ควรใช้การเพาะเลี้ยงสำรองในขณะที่เก็บรักษาด้วยความเย็นเพื่อป้องกันความล้มเหลวของการแช่แข็ง
6. วิธีการแช่แข็ง:
(1) วิธีดั้งเดิม: 4 oC 10 นาที ---> -20 oC 30 นาที ---> -80 oC 16-18 ชั่วโมง (หรือข้ามคืน) ---> การเก็บรักษาระยะยาวในเฟสไอของถังไนโตรเจนเหลว .
(2) โปรแกรมทำความเย็น: ใช้เครื่องทำความเย็นความเร็วคงที่เพื่อลดอุณหภูมิห้องเป็น –120 oC ที่อัตรา –1 ~ -3 oC/นาที และเก็บไว้ในเฟสไอของถังไนโตรเจนเหลวเป็นเวลานาน การจัดเก็บระยะ เหมาะสำหรับการเก็บรักษาเซลล์แขวนลอยและไฮบริโดมา
7. วัสดุ:
(1) เซลล์เพาะเลี้ยงที่เติบโตได้ดี
(2) สดปานกลาง
(3) DMSO (ซิกมา D-2650)
(4) หลอดพลาสติกถนอมอาหารด้วยการแช่เยือกแข็ง (Nalgene 5000-0020)
(5) 0.4% w/v trypan blue (GibcoBRL 15250-061)
(6) แผ่นฮีโมไซโตมิเตอร์และฝาครอบกระจก
(7) เครื่องทำความเย็นความเร็วคงที่ (KRYO 10 Series II)
8. ขั้นตอน:
(1) เปลี่ยนอาหารครึ่งหนึ่งหรือเต็มจำนวนหนึ่งวันก่อนแช่แข็ง และสังเกตการเติบโตของเซลล์
(2) การเตรียมสารละลายแช่เยือกแข็ง (การเตรียมก่อนใช้งาน): เพิ่ม DMSO ลงในอาหารสด ความเข้มข้นสุดท้ายคือ 5-10% ผสมให้เข้ากัน และวางที่อุณหภูมิห้องเพื่อใช้ในภายหลัง
(3) ตามการทำงานของเซลล์ย่อย ให้รวบรวมเซลล์ที่เพาะเลี้ยงแล้วนำสารแขวนลอยของเซลล์จำนวนเล็กน้อย (ประมาณ 0.1 มล.) มานับความเข้มข้นของเซลล์และอัตราการรอดชีวิตก่อนแช่แข็ง
(4) Centrifuge ขจัด supernatant เติมสารละลาย cryopreservation solution ในปริมาณที่เหมาะสมเพื่อให้เซลล์มีความเข้มข้น 1-5 x 106 เซลล์/ml ผสมให้เข้ากัน แล้วเทลงในหลอด cryopreservation tube 1 ml/ขวด ที่มีฉลากกำกับไว้ว่า ปริมาณสารแขวนลอยเซลล์สำหรับการตรวจจับการปนเปื้อน
(5) วิธีการเก็บรักษาด้วยความเย็น 1: วางหลอดแช่เย็นที่อุณหภูมิ 4 oC เป็นเวลา 10 นาที → -20 oC เป็นเวลา 30 นาที → -80 oC เป็นเวลา 16 ถึง 18 ชั่วโมง (หรือข้ามคืน) → เฟสไอของถังไนโตรเจนเหลวสำหรับการจัดเก็บในระยะยาว
(6) วิธีการจัดเก็บแบบแช่แข็ง 2: ท่อเยือกแข็งถูกวางในเครื่องทำความเย็นด้วยความเร็วคงที่โดยใช้โปรแกรมที่ตั้งไว้ แล้ววางลงในถังไนโตรเจนเหลว
หลอดหมุนเหวี่ยง

หลอดหมุนเหวี่ยง

รุ่นสินค้า ......

หลอดไมโครเซนตริฟิวจ์

หลอดไมโครเซนตริฟิวจ์

รุ่นสินค้า ......

เคล็ดลับปิเปต

เคล็ดลับปิเปต

รุ่นสินค้า ความจุ ......

เคล็ดลับการกรอง

เคล็ดลับการกรอง

หมายเลขผลิตภัณฑ์ ความจุ......

อ่างล้างหน้า

อ่างล้างหน้า

รุ่นสินค้า ความจุ ......

โอนปิเปต

โอนปิเปต

รุ่นสินค้า ความยา......

PCR หลอด

PCR หลอด

รุ่นสินค้า ความจุ ......

แผ่น PCR

แผ่น PCR

หมายเลขผลิตภัณฑ์ ความจุ......

การเพาะเลี้ยงลูปและเข็ม

การเพาะเลี้ยงลูปและเข็ม

รุ่นสินค้า ความจุ ......

เครื่องกระจายเซลล์

เครื่องกระจายเซลล์

รุ่นสินค้า วัสดุ ......