1. เซลล์ที่จะแช่เย็นควรอยู่ในสภาพเจริญเติบโตดี (ระยะล็อก) และมีอัตราการรอดชีวิตสูง โดยมีความหนาแน่นประมาณ 80-90%
2. ตรวจสอบว่าเซลล์ยังคงรักษาคุณสมบัติเฉพาะของตนไว้ก่อนที่จะแช่แข็งหรือไม่
ตัวอย่างเช่น ไฮบริโดมาควรได้รับการทดสอบสำหรับการผลิตแอนติบอดีหนึ่งถึงสองวันก่อนการเก็บรักษาด้วยการแช่เยือกแข็ง
3. ใส่ใจกับคุณภาพของสารป้องกันความเย็น
DMSO ควรเป็นเกรดรีเอเจนต์ ปลอดเชื้อ และไม่มีสี (กรองด้วย FGLP Telflon 0.22 ไมครอนหรือผลิตภัณฑ์ที่ซื้อโดยตรงที่ปลอดเชื้อ เช่น Sigma D-2650) แบ่งเป็นส่วนย่อยในปริมาณเล็กน้อย 5-10 มล. และเก็บที่อุณหภูมิ 4 oC ในที่มืด อย่าละลายน้ำแข็งหลายครั้ง กลีเซอรอลควรเป็นเกรดรีเอเจนต์และเก็บไว้ในที่มืดหลังจากการนึ่งฆ่าเชื้อ ใช้ภายใน 1 ปีหลังเปิดใช้ เพราะจะเป็นพิษต่อเซลล์หลังการเก็บรักษาเป็นเวลานาน
4. ความเข้มข้นของเซลล์ในการเก็บรักษาด้วยความเย็น:
(1) ไฟโบรบลาสต์ของมนุษย์ปกติ: 1~3 x 106 เซลล์/มล.
(2) ไฮบริโดมา: 1~3 x 106 เซลล์/มล. ความเข้มข้นของเซลล์ไม่ควรสูงเกินไป ไฮบริโดมาบางตัวจะตายหลังจากการละลาย 24 ชั่วโมงเนื่องจากความเข้มข้นของการแช่แข็งสูง
(3) เส้นเนื้องอกที่เกาะติดกัน: 5~7 x 106 ขึ้นอยู่กับชนิดของเซลล์ มะเร็งต่อมน้ำเหลืองต้องการความเข้มข้นที่สูงขึ้นหลังจากการละลาย ในขณะที่ HeLa ต้องการเพียง 1-3 x 106 เซลล์/มล.
(4) สารแขวนลอยอื่นๆ: 5~10 x 106 เซลล์/มล. ลิมโฟไซต์ของมนุษย์ต้องมีอย่างน้อย 5 x 106 เซลล์/มล.
5. ความเข้มข้นของสารป้องกันความเย็นคือ 5 หรือ 10% DMSO หากสภาวะการแช่แข็งของเซลล์ไม่แน่นอน ควรใช้การเพาะเลี้ยงสำรองในขณะที่เก็บรักษาด้วยความเย็นเพื่อป้องกันความล้มเหลวของการแช่แข็ง
6. วิธีการแช่แข็ง:
(1) วิธีดั้งเดิม: 4 oC 10 นาที ---> -20 oC 30 นาที ---> -80 oC 16-18 ชั่วโมง (หรือข้ามคืน) ---> การเก็บรักษาระยะยาวในเฟสไอของถังไนโตรเจนเหลว .
(2) โปรแกรมทำความเย็น: ใช้เครื่องทำความเย็นความเร็วคงที่เพื่อลดอุณหภูมิห้องเป็น –120 oC ที่อัตรา –1 ~ -3 oC/นาที และเก็บไว้ในเฟสไอของถังไนโตรเจนเหลวเป็นเวลานาน การจัดเก็บระยะ เหมาะสำหรับการเก็บรักษาเซลล์แขวนลอยและไฮบริโดมา
7. วัสดุ:
(1) เซลล์เพาะเลี้ยงที่เติบโตได้ดี
(2) สดปานกลาง
(3) DMSO (ซิกมา D-2650)
(4) หลอดพลาสติกถนอมอาหารด้วยการแช่เยือกแข็ง (Nalgene 5000-0020)
(5) 0.4% w/v trypan blue (GibcoBRL 15250-061)
(6) แผ่นฮีโมไซโตมิเตอร์และฝาครอบกระจก
(7) เครื่องทำความเย็นความเร็วคงที่ (KRYO 10 Series II)
8. ขั้นตอน:
(1) เปลี่ยนอาหารครึ่งหนึ่งหรือเต็มจำนวนหนึ่งวันก่อนแช่แข็ง และสังเกตการเติบโตของเซลล์
(2) การเตรียมสารละลายแช่เยือกแข็ง (การเตรียมก่อนใช้งาน): เพิ่ม DMSO ลงในอาหารสด ความเข้มข้นสุดท้ายคือ 5-10% ผสมให้เข้ากัน และวางที่อุณหภูมิห้องเพื่อใช้ในภายหลัง
(3) ตามการทำงานของเซลล์ย่อย ให้รวบรวมเซลล์ที่เพาะเลี้ยงแล้วนำสารแขวนลอยของเซลล์จำนวนเล็กน้อย (ประมาณ 0.1 มล.) มานับความเข้มข้นของเซลล์และอัตราการรอดชีวิตก่อนแช่แข็ง
(4) Centrifuge ขจัด supernatant เติมสารละลาย cryopreservation solution ในปริมาณที่เหมาะสมเพื่อให้เซลล์มีความเข้มข้น 1-5 x 106 เซลล์/ml ผสมให้เข้ากัน แล้วเทลงในหลอด cryopreservation tube 1 ml/ขวด ที่มีฉลากกำกับไว้ว่า ปริมาณสารแขวนลอยเซลล์สำหรับการตรวจจับการปนเปื้อน
(5) วิธีการเก็บรักษาด้วยความเย็น 1: วางหลอดแช่เย็นที่อุณหภูมิ 4 oC เป็นเวลา 10 นาที → -20 oC เป็นเวลา 30 นาที → -80 oC เป็นเวลา 16 ถึง 18 ชั่วโมง (หรือข้ามคืน) → เฟสไอของถังไนโตรเจนเหลวสำหรับการจัดเก็บในระยะยาว
(6) วิธีการจัดเก็บแบบแช่แข็ง 2: ท่อเยือกแข็งถูกวางในเครื่องทำความเย็นด้วยความเร็วคงที่โดยใช้โปรแกรมที่ตั้งไว้ แล้ววางลงในถังไนโตรเจนเหลว
英语
阿拉伯语
���ļ���